II.- MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE SUPERVIVENCIA

Criterio de muerte de un microorganismo: pérdida irreversible de la capacidad de reproducción en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan técnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse están muertos. Esto se determina generalmente mediante métodos cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias.

Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo. Si representamos gráficamente el logaritmo del número de supervivientes frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice sólamente que fracción de la población inicial sobrevive a un determinado período de tratamiento. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer además el tamaño inicial de la población. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilización hay que tener en consideración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño de la población inicial. En la práctica de la esterilización la población microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamaño de la población inicial y la tasa de mortalidad de los miembros más resistentes de la población mixta. Para asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

III.- CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

Temperatura: a mayor temperatura mayor acción.

Tipo de microorganismo: las células vegetativas en desarrollo son mucho más susceptibles que las esporas.

Estado fisiológico de las células: las células jóvenes son más vulnerables que las viejas.

Ambiente:

• El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino.

• La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetración del agente.

• Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia térmica de los organismos.

• La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia de los agentes químicos antimicrobianos por inactivar éstos o proteger al microorganismo.

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos para destruir microorganismos. Hay que distinguir entre calor húmedo y calor seco. El húmedo mata los microorganismos porque coagula sus proteínas siendo más rápido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes químicos. La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposición al calor seco para obtener los mismos resultados.

A.- Esterilización por calor húmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturación y a presión es el agente más práctico para esterilizar ya que el vapor a presión proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullición. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presión interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión atmosférica lo cual corresponde a una temperatura de 120° C. El tiempo de exposición depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120° C; si los volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor empleándose en estos casos otros métodos de esterilización.

Tindalización: Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por encima de 100° C sin que resulten dañadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas son destruidas.

Pasteurización: La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que sólo matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estéril. La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo térmico mortal de microorganismos patógenos (es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos patógenos más resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60° C. Posteriormente se descubrió que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es más resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurización de la leche se realiza a 62,8° C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7° C durante 15 segundos (Flash-Pasteurización).

B.- Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales sólidos estables al calor)

Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160° C.

Incineración: La destrucción de los microorganismos por incineración es una práctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.

2.- Bajas Temperaturas

3.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes

Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60 pero son difíciles de controlar ya que este isótopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.

Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones): Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.

B.- Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta: La porción ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos.

4.- Filtración

Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos) son termolábiles. Otros agentes físicos como las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprácticos para esterilizarlos, por lo que se recurre a la filtración a través de filtros capaces de retener los microorganismos. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos. Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.

A.- Filtros de membrana

Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa con poros tan pequeños que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros son desechables. Además de utilizarse en la esterilización de líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua.

B.- Filtros HEPA

Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) está compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

5.- Desecación

La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su actividad metabólica. Este proceso físico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeración. El tiempo de supervivencia de los microorganismos después de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son más susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer viables indefinidamente.

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS

1.- Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico para los microorganismos, de manera que pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del tratamiento. Normalmente se utiliza el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10,7° C. Se usa en la industria para la esterilización de placas Petri, jeringas y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-CH2CH2O-H).

2.- Glutaraldehido: Una solución acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urológicos y ópticos.

VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Esterilización: es el proceso de destrucción de todas las formas de vida microbiana.

Desinfección: es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos.

Desinfectantes: son aquellas sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patógenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Antisépticos: son aquellas sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de los microorganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

A.- INORGANICOS

1.- Metales: Los más efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actúan inactivando las proteínas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos en heridas superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antisépticos está el nitrato de plata (AgNO3) que en solución al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonocócicas en los ojos de los recién nacidos aunque actualmente se está reemplazando por antibióticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. También es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fúngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Los compuestos de zinc también son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pié de atleta.

2.- Acidos y álcalis: Actúan alterando la permeabilidad y coagulando las proteínas. En general los ácidos son más eficaces que los álcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3), hidróxido sódico (NaOH) e hidróxido potásico (KOH). Tienen aplicación limitada debido a su naturaleza cáustica y corrosiva. Aún así el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera.

3.- Compuestos inorgánicos oxidantes: actúan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico en pequeñas heridas de la piel.

4.- Halógenos: Los halógenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halógenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las células microbianas.

Cloro: La muerte de los microorganismos por acción del cloro se debe en parte a la combinación directa del cloro con las proteínas de las membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia de agua desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (ácido hipocloroso)

HClO ----------------> HCl + O (oxígeno naciente)

El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1% se puede utilizar como desinfectante doméstico.

Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su acción antimicrobiana es debido a su acción oxidante. Además la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el aminoácido tirosina resulta en la inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se puede utilizar como antiséptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solución alcohólica (tintura) de iodo (I2) más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii) iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona (PVP). Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel así como en la desinfección de pequeñas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.

B.- ORGANICOS

1.- Alcoholes: El alcohol metílico (1C) es menos bactericida que el etílico (2C) y además es altamente tóxico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al del propílico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antiséptico de la piel y como desinfectante en los termómetros clínicos orales y algunos instrumentos quirúrgicos.

2.- Fenol y compuestos fenólicos: Una solución acuosa al 5% de fenol mata rápidamente a las células vegetativas de los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho más resistentes al fenol. Debido a que el fenol es tóxico y tiene un olor desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antiséptico, siendo reemplazado por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del fenol menos tóxicas y más activas frente a los microorganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenólicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos fenólicos actúan alterando la permeabilidad de la membrana citoplásmica así como desnaturalizando proteínas.

VII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

1.- Técnica de dilución en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente químico. El mismo volumen de cada dilución se dispensa en tubos estériles. A cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparición de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico mata al microorganismo utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico durante ese período de tiempo.

2.- Técnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición (crecimiento -) alrededor del agente químico. Una modificación de esta técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano.

3.- Técnica del coeficiente fenólico: Es una técnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación de la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alícuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estéril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparición de turbidez). (vi) La mayor dilución del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados. El número obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.